对微型生物反应器样品中的单克隆抗体进行自动化高通量LC-MS聚焦肽图分析

为促进细胞系选择和生物工艺优化，本研究开发出一种自动化高通量(HT)样品前处理方法和快速LC-MS肽图分析方法，来测定小体积低浓度微型生物反应器样品中的关键质量属性(CQA)肽。该方法使用Andrew+™自动化平台对溶于中和的蛋白A亲和色谱洗脱缓冲液的30 µL 1 mg/mL单克隆抗体(mAb)样品进行缓冲液置换和胰蛋白酶酶解。使用ACQUITY™ Premier CSH™ C₁₈肽分析专用住分离所得的肽，并用BioAccord™ LC-MS系统进行检测。结果证明，选定的CQA肽（包括N-糖基化肽、脱酰胺肽和氧化肽）得到了有效分析。自动化制备48个样品耗时3.5小时，其中酶解时间为2小时，每个样品的LC-MS分析时间为10 min。除蛋白A纯化的mAb外，该方法还适用于分析其他含少量蛋白质的样品。

优势

• 即使在低浓度下，对30 µg mAb中的CQA肽进行相对定量也能获得一致的结果
•  Andrew+机器人平台的自动化胰蛋白酶酶解方案，使用抗自切性强的新型市售胰蛋白酶（RapiZyme™胰蛋白酶）
• 使用ESI-ToF BioAccord LC-MS对CQA肽进行高通量(HT) LC-MS分析，并使用waters_connect™ Peptide MAM应用程序软件自动分析数据

多年来，单克隆抗体(mAb)等重组蛋白生物药物帮助了大量患者摆脱疾病困扰。重组蛋白的开发和生产可能产生高昂成本，而在开发高效的高质量产品生产工艺方面，宿主细胞系选择和生物工艺优化是一个潜在瓶颈。为了缩短细胞系选择和工艺优化所需的时间，我们在早期工艺开发阶段使用了微型生物反应器¹。 近年来，产品质量已被纳入细胞系选择标准，部分原因是生产生物类似药的监管要求。虽然微型生物反应器具有能够接近大规模生物反应器生产条件的优势，但从微型生物反应器中采集的样品量可能会受到分析方面的限制。另一方面，分析样品的CQA（例如位点特异性修饰）通常需要通过LC-UV或LC-MS进行肽图分析，该过程可能费时费力且通量低。

本应用纪要介绍了一种自动程序，即使用Andrew+机器人(Andrew Alliance™)，在极少手动干预的情况下完成CQA肽图分析，来协助细胞系选择和细胞培养优化（图1）。本文介绍了一种聚焦或靶向肽图分析方法，用于监测选定CQA肽及其修饰形式的丰度。将30 µg 1 mg/mL mAb（英夫利昔单抗）样品还原并进行胰蛋白酶酶解，然后通过长达10分钟的反相分离结合MS检测来监测产生的CQA肽，以此来演示该方法。由于样品前处理过程中包含预浓缩步骤，因此该方法也适用于分析mAb和其他浓度低于1 mg/mL的蛋白质样品。

样品描述

蛋白A洗脱缓冲液用100 mM甘氨酸(pH 3)和1 M Tris (pH 7.5)以5:1的体积比中和，用来稀释英夫利昔单抗(10 mg/mL)。获得的英夫利昔单抗终浓度为1.0 mg/mL。

在样品降解实验中，将英夫利昔单抗(10 mg/mL)置于0.005% H₂O₂和50 mM磷酸钠溶液(pH 7.6)中，在37 °C下温育2周，诱导氧化和脱酰胺作用。此外，还将降解样品与原始的未降解样品以1:1的体积比混合。然后使用上述中和的蛋白A洗脱缓冲液将所有样品稀释至1.0 mg/mL。

通用程序

本研究针对小体积低浓度微型生物反应器mAb样品开发出一种使用LC-MS分析来监测CQA肽的自动化高通量(HT)肽图分析方法。多年来，制药行业一直将肽图分析用于多属性监测(MAM)²。 这些酶解程序通常使用100 µg或更多的蛋白质，因为产品表征研究通常需要大量浓缩样品。然而，在目前的应用中，从微型生物反应器获得的样品通常浓度和体积都较小。为使聚焦肽图分析的样品前处理更加高效，我们优化了盐酸胍浓度、蛋白质:酶比例、酶解时间等参数（数据未显示）。需要注意的是，本文所述方法的开发目的并不在于全面分析mAb的肽图，因此，在这些酶解条件下观察到明显的酶解不足情况。此外，该程序仅对样品进行二硫键还原，而不进行烷基化。

图2A展示了自动化聚焦肽图分析程序的主要步骤。用中和的蛋白A洗脱缓冲液将30 µg英夫利昔单抗稀释至1.0 mg/mL（详见实验部分）。假设mAb已经使用蛋白A亲和色谱树脂进行了亲和纯化。

该方法的第一步是将样品加入变性和还原缓冲液（DRB、6 M盐酸胍、1 mM甲硫氨酸、3 mM DTT和0.1 M Tris pH 7.5）中进行缓冲液置换，如图2B所示。此步骤在Andrew+自动化系统上使用Extraction+ Domino完成，并使用10 K MWCO滤板保留样品。上样前，向滤板孔中加入50 µL水，并在650 mbar下施加10分钟真空，使滤板中的水排出。我们发现，此活化步骤可以加快后续步骤中的缓冲液排放³。 随后加入20 µL 6 M盐酸胍、2.5 mM甲硫氨酸、0.1 M Tris pH 7.5溶液和30 µL mAb (1.0 mg/mL)，在650 mbar下施加12分钟真空，以排出缓冲液，同时保留mAb。然后向孔中加入DRB (30 µL)。要将样品从滤板转移至96孔Eppendorf PCR板，需要将滤板翻转到PCR收集板上方，并以500 RPM的转速离心2分钟。需要注意的是，这种翻转和离心操作需要用户完成，并且会以镜像方式改变样品的孔位置。

完成变性并在25 °C下还原30分钟后，加入100 µL 0.15 mg/mL RapiZyme胰蛋白酶（一种改性胰蛋白酶，溶于1.0 mM甲硫氨酸和0.1 M Tris pH 7.5中），以降低盐酸胍的浓度，同时酶解mAb。将反应混合物在37 °C下温育2小时，然后加入10 µL 2%乙酸终止酶解。最后，加入0.10%甲酸（流动相A）稀释反应混合物，使酶解蛋白质的终浓度约为0.20 mg/mL。

此程序有几点值得注意。首先，如果样品浓度较低，缓冲液置换步骤可能会导致样品预浓缩。在当前的演示实验中，上样量为30 µL，回收了30 µL。但是，如果样品浓度较低，可以增加上样体积，回收时通过减少体积浓缩样品。其次，进行烷基化和不进行烷基化的结果相当。因此，该程序不包括烷基化步骤。第三，该程序中使用的胰蛋白酶自切程度非常低，这一优势有利于高浓度使用，从而加快酶解速率。图3A和3B分别显示了在ACQUITY Premier CSH C₁₈, 2.1 x 100 mm肽分析专用柱上以50分钟梯度运行的空白酶解物和英夫利昔单抗酶解物。注：本实验选择了ACQUITY Premier CSH C18肽分析专用柱，每批合成的CSH C18颗粒均使用蛋白质的胰蛋白酶解物进行了QC测试，不符合性能规格的批次将视为不合格，通过这种方式来确保柱间性能的一致性。即使Rapizyme胰蛋白酶含量较高且蛋白质与酶的比例为2:1，空白酶解物中也未显示出过多的胰蛋白酶干扰峰。

在高通量分析中，酶解物的洗脱梯度运行时间仅6分钟。正如预期所料，6分钟梯度（图3C）的色谱分离度低于50分钟梯度（图3B）。由于该方法的目标仅在于完成CQA肽的相对定量（使用观察到的电荷态的组合离子计数计算），而不是完全表征蛋白质，因此6分钟梯度已经足够满足要求。

图4显示了本实验的Andrew+布局。使用Andrew+自动化平台，酶解48个样品只需不到3.5小时，并且省去了七个手动移液步骤。

重现性

自动化样品前处理和LC-MS分析为一系列CQA肽提供了可接受的重现性。本研究使用48样品方案来酶解英夫利昔单抗样品（30 µL，1.0 mg/mL）。从样品板上选择10个不同位置的样品进行LC-MS分析（图5）。使用waters_connect信息学平台和Peptide MAM应用程序软件执行自动化数据分析。表1和图6显示了所评估的CQA肽的相对丰度，以及这些测量值的相对标准偏差。结果发现，进样体积为10 µL (2 µg mAb)时，与进样体积为5 µL (1 µg)相比，得到的结果更一致。在本例中，进样量超过2 µg并没有进一步改善重现性结果。对于所有20种CQA肽，修饰百分比的%RSD均小于20% (n=10)，在%RSD介于10%~20%之间的8种CQA肽中，有7种的修饰水平为1.66%或更低。氧化肽的RSD%略高，原因正在调查中。总体而言，这些数据表明，在蛋白质位点特异性修饰的相对丰度测量方面，该HT LC-MS方法可以使用少量(30 µg)样品提供一致的结果。

降解样品分析

在细胞系选择和工艺优化中，使用能够检测CQA肽修饰百分比变化的方法非常重要。为证明该方法符合预期目标，我们对样品进行了降解，以增加对氧化和脱酰胺作用的研究（详见实验部分）。还将降解样品与未降解样品混合（体积比1:1）。图7A显示了几种英夫利昔单抗CQA肽的修饰百分比。所评估的四种氧化CQA肽和三种脱酰胺CQA肽的LC-MS数据与具有中等水平降解肽的1:1混合样品一致。观察到脱酰胺HC:T37肽NQVSLTCLVK（图7A中的f）的丰度从0.1%增加到0.6%，这一结果很好地说明了该分析检测CQA变化的灵敏度。未修饰（上图）和脱酰胺（下图）肽的质谱图如图7B所示。根据保留时间，这种脱酰胺形式很可能是由天冬酰胺转化而来的天冬氨酸。图7C显示了N-糖修饰肽和C端重链(HC)肽的结果。HC C端肽的C端可以带或不带赖氨酸残基。正如预期所料，这些稳定的肽修饰获得了一致的修饰百分比。总体而言，结果表明，这种自动化HT CQA肽图分析方法能够检测不同生物工艺样品之间的位点特异性变化。

本文所述方法采用Andrew+机器人平台的自动化胰蛋白酶酶解方案，并使用抗自切性强的新型胰蛋白酶：RapiZyme胰蛋白酶，该产品与其他测序级胰蛋白酶产品相比具有更高的活性，使30 µg mAb样品的CQA肽相对定量获得了一致的结果^4.5。 这种自动化胰蛋白酶酶解方法能够在4小时内生成48个样品。此外，ESI-ToF BioAccord LC-MS方法的总运行时间仅10分钟，得到的LC-MS数据可通过waters_connect使用Peptide MAM应用程序软件自动处理。

本应用纪要所述的通用程序展示了机器人平台的功能和所用的LC-MS方法，该方法可轻松优化，以满足其他蛋白质样品的特定分析要求。

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