• 应用纪要

使用RapiZyme™胰蛋白酶和IonHance™ DFA进行快速、稳定的LC-UV-MS肽图分析

使用RapiZyme™胰蛋白酶和IonHance™ DFA进行快速、稳定的LC-UV-MS肽图分析
  • Abraham S. Finny
  • Nick Zampa
  • Balasubrahmanyam Addepalli
  • Matthew A. Lauber
  • Waters Corporation
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摘要

使用新型RapiZyme胰蛋白酶和IonHance二氟乙酸(DFA)，费力且耗时的肽图分析方案变得更快、更稳定。RapiZyme胰蛋白酶具有高活性且抗自切性更强，因此可以增加用量，从而缩短酶解时间（约1小时），这与蛋白质测序方法中采用的传统酶-蛋白质比例和较长的酶解时间（≥3小时）形成对比。在肽图分析工作流程中使用IonHance DFA作为流动相添加剂，可以避免加合物引起的干扰，采集高质量质谱(MS)和UV数据。使用Waters MassPREP™肽混标和NISTmAb作为蛋白质酶解标准品，我们直接比对了高质量UV和MS数据，同时在无加合物目标肽分子离子的MSe碎裂中保持序列信息碎片离子的高信号强度。因此，在初始实验中将肽峰注释为特定保留时间后，可以考虑仅使用UV进行后续质量控制(QC)分析。由于现在可以在拥有简便性和效率的同时获得高质量结果，这种改进的方法有望加速药物蛋白质的测试。

优势

  • 使用RapiZyme胰蛋白酶可实现1:5的酶-蛋白质比例酶解，从而缩短酶解时间
  • 样品前处理时间总共不到3小时，明显少于许多传统的肽图分析工作流程
  • 与甲酸相比，IonHance DFA以不依赖序列的方式提高了UV灵敏度，有助于监测低丰度肽
  • IonHance DFA的离子对特性进一步提高了肽保留时间的重现性，同时在没有相关加合物的情况下保持灵敏的响应

简介

肽图分析是一种蛋白质组学和生物制药表征技术，可用于鉴定和表征蛋白质。单链蛋白质也称为多肽。多肽的区分特征在于，它的氨基酸序列是通过肽键连接的。在蛋白质组学研究中，我们通过胰蛋白酶等蛋白酶裂解肽键将蛋白质分解成更小的肽，然后通过液质联用法(LC-MS)进行分离和质谱分析。生成的肽图可用于鉴定蛋白质并确定其一级结构。出于多种原因，稳定的肽图分析是十分必要的。首先，肽图分析可用于确认蛋白质的身份，这对于质量控制和验证目的很重要。其次，肽图分析可用于确定蛋白质的一级结构，这对于早期研究计划至关重要。最后，肽图分析可以检测氨基酸序列中的翻译后修饰，这会影响蛋白质的功能和稳定性。

本应用纪要介绍了RapiZyme胰蛋白酶和IonHance DFA在肽图分析中的应用，并讨论了这种组合在促进快速肽图分析工作流程、同时优化UV和MS响应以及无加合物质谱方面的独特优势。

实验

样品前处理

NIST mAb样品[10 µL，10 µg/µL]在室温下用90 µL 6 M盐酸胍(GuHCl) [5.4 M终浓度]溶液变性，并用5 mM二硫苏糖醇(DTT) [2 µL，250 mM]还原30分钟。随后在室温下用10 mM碘乙酰胺(IAM) [3 µL，350 mM]烷基化30分钟。

脱盐方案

酶解缓冲液由10 mM氯化钙(CaCl2)和0.1 M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)组成，首先由Waters Tris CaCl2缓冲盐（pH 7.5，4个/包，P/N：186010111）制备。分三次加入400 µL酶解缓冲液，每次丢弃洗脱液，以此来平衡基于重力流体积排阻色谱(SEC)的脱盐小柱。然后将100 µL变性NIST mAb样品加载到色谱柱上并丢弃流出的溶液。用100 µL酶解缓冲液清洗色谱柱，丢弃流出的溶液。确保小柱无残留液滴后，将样品收集容器置于小柱下方，用300 µL酶解缓冲液收集脱盐后的蛋白质。

估计蛋白质含量

为确保将正确含量的变性和烷基化NIST mAb用于酶解，在脱盐步骤后估计蛋白质含量。使用紫外-可见光读板仪通过A280测量获得精确的浓度读数。或者，也可以通过液滴的紫外-可见光测量来估计蛋白质含量。此步骤为可选，有助于确保酶解的蛋白质含量正确，以便始终保持一致的酶-蛋白质比例值，在多次酶解过程中保持可重现的信号行为。

蛋白酶解

将20 µg (200 µL)变性、还原和烷基化NIST mAb放入300 µL PCR（聚丙烯）管中，并以1:5的酶:蛋白质比例加入4 µg (4 µL) RapiZyme胰蛋白酶（P/N：186010108）以执行酶解。该溶液于37°C下在旋转PCR模块上以300 RPM温育1小时。酶解后，用20 µL 1% 甲酸（0.1%终浓度）酸化样品来淬灭反应。将样品涡旋并定量转移到Qsert样品瓶中用于LC-MS分析。

液相色谱条件

液相色谱系统：

ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS

检测：

ACQUITY TUV/PDA

波长：

219 nm

样品瓶：

12×32 mm螺口透明玻璃Qsert样品瓶，容积300 µL (P/N: 186002804)

色谱柱：

ACQUITY Premier Peptide CSH™ C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm (P/N: 186009489)

柱温：

65 °C

样品温度：

6 °C

进样体积：

50 µL

流速：

0.25 mL/min

流动相A：

0.1% (v/v) IonHance DFA (P/N: 186009201)的LCMS级水溶液

流动相B：

0.07% (v/v) IonHance DFA的LCMS级乙腈溶液

梯度：

请参考下表。

梯度表

质谱条件

MS系统：

ACQUITY RDa

电离模式：

碎裂模式下的全扫描

采集范围：

低(50~2000 m/z)

毛细管电压：

1.20 kV

锥孔电压：

20 V

碎裂锥孔电压：

60 V~120 V

极性：

正

扫描速率：

2 Hz

脱溶剂气温度：

350 °C

数据管理

色谱软件：

UNIFI™ v3.0.0.15，Empower™ 3（仅用于UV分析）

质谱软件：

UNIFI v3.0.0.15

信息学软件：

UNIFI v3.0.0.15
 MassPREP肽混标中九种肽的肽序列

结果与讨论

当前研究旨在证明RapiZyme胰蛋白酶和IonHance DFA在快速、稳定的LC-UV-MS肽图分析工作流程中的有利作用。使用NIST mAb作为目标生物制药蛋白质示例，我们评估了RapiZyme胰蛋白酶在1:5的酶-蛋白质比例和1小时酶解时间下的效力。随后使用IonHance DFA作为液相色谱中的流动相添加剂对所得肽进行LC-UV-MS分析。

该分析显示重链和轻链的氨基酸序列覆盖率为100%（图1）。正如对甲酸流动相的预期一样，经DFA改性的流动相没有产生任何离子对加合物（图2），也没有发现对质谱数据的整体质量有任何不利影响，包括序列信息子离子的采集。此外，UV色谱图显示出更强的UV信号和微小的基线漂移。分别独立制备的蛋白质酶解物的一致UV和BPI色谱图证明了该方案的重现性（图3-4）。

图1.代表性总离子流色谱图(TIC)和NISTmAb序列的实测序列覆盖率。如方法中所述，使用BioAccord LC-MS系统对约5 µg蛋白质酶解物进行LC-UV-MS分析。MSe数据通过UNIFI肽图分析数据分析方法进行分析，鉴定胰蛋白酶解肽的高置信度氨基酸序列并计算序列覆盖率。
图2.DFA加合物的LC-MS谱图分析。
(A)上图为经RapiZyme胰蛋白酶酶解的NISTmAb蛋白的基峰离子色谱图(BPI)。43.5分钟处的肽峰显示出最高离子丰度，如m/z 603.3374（对应于肽VVSVLTVLHQDWLNGK）的BPI和提取离子流色谱图(XIC)中所见（中图）。如果形成加合物，明显这种肽的信号丰度应该最高。但是，m/z 635.006（对应于DFA加合物，考虑质子置换后+95 Da）的XIC（下图）没有产生清晰的峰，因为信号处于基线水平（参见下图的强度）。
(B) 43–43.5 min对应的质谱图显示不存在对应于加合物的离子（见箭头）。
图3.三个分别独立制备的NISTmAb酶解物重复样的UV色谱图的重现性。三种酶解物在219 nm处的UV信号保持恒定，表明重现性高。
图4.三个分别独立制备的NISTmAb酶解物重复样的BPI色谱图的重现性。三种酶解物在219 nm处的UV信号保持恒定，表明重现性高。

该方案的第一个优势是样品前处理过程快速，不到3小时。部分原因在于RapiZyme胰蛋白酶能够促进高比例酶:蛋白质的酶解。第二个优势是色谱图显示出较高的UV信号强度。这可以归因于DFA与甲酸的折射率特性差异以及DFA离子对提供的峰形改善。第三个优势是IonHance DFA在实现无加合物质谱方面的作用。最后，通过比较独立制备的样品之间的UV和BPI色谱图，证明了肽图分析的出色重现性。

为什么需要快速肽图分析工作流程？

快速肽图分析工作流程可以为致力于研究、开发和放行蛋白质药物的实验室和公司提供即时结果。较长的酶解和样品前处理时间可能会引入或允许形成样品干扰，从而对分析质量产生不利影响。快速肽图分析工作流程还可以在大规模研究中实现自动化的高通量分析，使QC分析更快、更不容易出错。结果周转时间缩短意味着决策速度可以更快，而减少干扰可以帮助确保在项目研究的第一阶段即可报告正确的结果。

为什么使用IonHance DFA增强紫外信号？

在大多数基于LC-MS的肽图分析中，甲酸通常优于三氟乙酸(TFA)，因为甲酸具有灵敏的MS响应，并且可以获得无加合物的质谱。然而，有些肽在使用甲酸流动相时不易检出（示例见图5），因为它不具有TFA的离子对特性，无法改善色谱保留1。 MassPREP肽混标(P/N: 186002337)在紫外检测中的行为证明了这一点。在这些条件下，肽1于任何波长(210–225 nm)下都无法检出。目前尚不清楚这种肽是部分还是完全被推入死体积，从而导致信号丢失。

图5.使用甲酸流动相对MassPREP肽混标(P1–P9)中的肽进行LC-UV检测。无法从该特性曲线中明确破译P1的存在（参见色谱图上的矩形区域）。请注意P9与P8相比洗脱模式的变化。

另一方面，IonHance DFA具有离子对特性（更像TFA）；因此，预期能以不依赖于肽的方式获得更好的保留和UV灵敏度。凭借这一点，我们期望尽可能获得高质量的UV色谱图。为了确定在使用IonHance DFA时最适合肽测量的UV波长，我们在210~225 nm的检测波长范围内对MassPREP肽混标进行了LC-UV分析。尽管UV基线表现出波长依赖性漂移，但MassPrep肽混标中预期的九种肽在所有情况下都可以检出（图6）。虽然在210 nm处观察到最强信号，但基线向下漂移，这可能会干扰定量。另一方面，219 nm处的基线相对稳定，肽信号在此波长下没有遭受明显损失（图7）。稍微降低流动相B中DFA的浓度可进一步改善并获得可重现的基线行为。重要的是，所有预期的肽，包括肽1都可以检出，不存在任何不确定性。因此，将219 nm确定为获得水平基线和不依赖于肽的UV信号采集的理想波长。

 图6.使用IonHance DFA流动相对MassPREP肽混标(P1-P9)中的肽进行LC-UV检测。从该特性曲线中可以很容易地明确破译P1的存在。注意，与甲酸流动相相比，P9的洗脱顺序有变化且信号改善。
图7.使用IonHance DFA流动相在210–225 nm的紫外波长范围内检出的所有肽的峰面积比较。

强大、可靠的紫外(UV)信号可为肽图分析提供多项优势。

  • 提高灵敏度：不依赖序列的紫外识别可以有效检测低丰度肽2。
  • 提高准确度：在色谱图中提供清晰明确的峰3。
  • 改善分离度：色谱图中的共洗脱更少，改进了复杂多肽混合物的分析2。
  • 提高重现性：提供更一致和可靠的结果3。

此外，在用户可能还没有配备LC-MS技术的QC环境中，高质量UV色谱图使分析人员无需重复MS数据采集即可获得所需的肽图信息。这是因为分析级别的初始LC-UV-MS分析将有助于注释LC特性曲线中的肽峰，这种分析可以很容易地转移到QC环境中，而不会造成任何中间数据丢失或不确定性。

结论

肽图分析工作流程通常很复杂且耗时。因此，需要简单、可重现且稳定的工作流程来促进可靠的QC分析和监测，正如生物制药行业的情况。样品前处理是这些工作流程中的关键步骤，通常非常耗时；然而，RapiZyme胰蛋白酶可以帮助用户缩短样品前处理时间，如本应用纪要所示。此外，使用IonHance DFA作为流动相添加剂可通过高质量和可重现的数据采集获得可靠的LC-UV-MS肽图分析体验。这种方法有望成为一种平台方法，并能够在受到严格监管的环境中及时评估蛋白质治疗产品。

参考资料

  1. J. M. Nguyen, J. Smith, S. Rzewuski, C. Legido-Quigley, and M. A. Lauber, ‘High Sensitivity LC-MS Profiling of Antibody-Drug Conjugates With Difluoroacetic Acid Ion Pairing’, MAbs, vol.11, no.8, pp.1358–1366, Nov. 2019, doi: 10.1080/19420862.2019.1658492/SUPPL_FILE/KMAB_A_1658492_SM8763.DOCX.
  2. M. L. Gross, G. Chen, and B. N. Pramanik, ‘Protein and Peptide Mass Spectrometry in Drug Discovery’, p. 464, 2012.
  3. T. Mouchahoir and J. E. Schiel, ‘Development of an LC-MS/MS Peptide Mapping Protocol for the NISTmAb’, Anal Bioanal Chem, vol.410, no.8, pp.2111–2126, Mar. 2018, doi: 10.1007/S00216-018-0848-6/FIGURES/9.

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