幻覚性キノコに含まれるシロシビン、関連するトリプタミン、β-カルボリンの分離および検出のための単一の分析法

幻覚性キノコを疾患の治療に使用できることから、最近注目が集まっています。シロシビンを含むトリプタミンと既知の抗うつ薬のクラスに属する β-カルボリンの 2 つのクラスの活性化合物が、これらのキノコから見つかりました。この試験の目的は、単一のクロマトグラフィー分析法で 6 種のトリプタミンと 4 種の β-カルボリンのパネルを分離することでした。このパネルに含まれる化合物はルイス塩基として機能し、標準的なステンレススチール製 HPLC システムに含まれる金属酸化物層と相互作用することが知られています。MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）テクノロジーにより、分析種と金属酸化物の相互作用に関連する問題を解決できることがわかりました¹。 これは、ピークの面積と高さがそれぞれ最大 426% および最大 882% 増加しているクロマトグラフィー結果により実証されています。この記事では、Arc™ Premier システムを、Empower™ サンプルセットジェネレーター（SSG）および XSelect™ Premier HSS T3 カラムと組み合わせて使用して、10 種のトリプタミンと β-カルボリンのパネルを分離する分析法について説明します。

アプリケーションのメリット

• MaxPeak HPS テクノロジーを使用することで、標準的なステンレススチール製 HPLC システムと比較して、クロマトグラフィー性能が大幅に向上
• より環境に優しいメタノールを強溶媒として使用して開発された、より環境に配慮した分析法
• 単一の 15 分の分析法で、トリプタミンと β-カルボリンのパネルのベースライン分離が可能に
• Empower サンプルセットジェネレーターを使用した装置メソッドおよびサンプルセットの迅速な作成

ここ数年、幻覚性キノコに含まれる化合物の研究は再び注目を集めています。ほとんどの研究では、トリプタミンシロシビンの医薬品としての可能性、特に群発頭痛、不安、抑うつ、強迫神経症、心的外傷後ストレス障害、薬物乱用などの障害の治療における使用に焦点を当てています²。 これらのキノコは、医薬品としての可能性だけでなく、一部の地域では娯楽使用の合法化が増加傾向にあります³。

生のキノコの摂取における適切な摂取量の決定は、活性化合物の存在量がさまざまな属、種、変異、生長条件によって大きく異なるため、困難になる場合があります⁴。 さらに、幻覚性キノコを摂取すると、筋力低下などの有害反応が発生する事例も報告されています。この効果は、シロシビンに関連するトリプタミンの 1 つであるアエルギナシンに起因すると推測されています⁵。 これらのキノコに含まれる β-カルボリンは、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOI）の一種です。MAOI は一般に、抗うつ薬として処方されますが、トリプタミンの代謝に影響することもあります⁶。 この化合物の混合物によってもたらされる可能性のある良い相乗効果や悪い相乗効果については、まだ十分に調査されていません。臨床研究、安全性、投与の正確さを向上させるために、これらの化合物を分離するためのシンプルで迅速な分析法が必要とされています。

本稿では、10 種のトリプタミンと β-カルボリン化合物を分離するための HPLC 分析法の開発について紹介します。これらの化合物の化学構造を図 1 に示します。Empower SSG を使用して、分析法開発プロセスの最適化ステップにおける装置メソッドの作成を自動化しました。重要なこととして、Waters™ MaxPeak HPS テクノロジーを利用して、分析種と金属酸化物の相互作用に関連するリスクを大幅に低減しました。 

サンプルの説明

1:1 アセトニトリル：水に溶解したシロシビンおよびシロシンは、Sigma Aldrich（ドイツ、ダルムシュタット）から個別に入手しました。バエオシスチン、アエルギナシン、ノルバエオシスチン、ノルプシロシン、ハルマン、ハルミン、ノルハルマン、ハルマロールは Caymen Chemicals（米国、ミシガン州）から入手しました

幻覚性キノコに含まれる活性化合物を模倣するために、トリプタミンと β-カルボリンのパネルを標準試料から調製しました。これらの化合物は全般に、メタノールで抽出されています⁷。 このことを受けて、10 種すべての化合物のパネルを 5% 水、5% アセトニトリル、90% メタノール中に調製しました。シロシビン、シロシン、バエオシスチン、アエルギナシン、ノルバエオシスチン、ノルプシロシン、ハルマロールは 0.05 mg/mL になるように調製しました。ハルマン、ハルミン、ノルハルマンは 0.025 mg/mL になるように調製しました。

分析法開発

分析法開発プロセスにおいて、選択性が異なる 4 種類のカラムケミストリーをスクリーニングしました。これらのカラムには、XBridge™ Premier BEH C₁₈、XSelect Premier CSH C₁₈、XSelect Premier CSH Phenyl-Hexyl、XSelect Premier HSS T3 が含まれます。カラムはすべて 2.5 µm、4.6 × 100 mm でした。ピーク同定には、PDA 質量検出器と QDa 質量検出器の両方を使用してスクリーニングを実行しました。XSelect Premier HSS T3 カラムが、最良のクロマトグラフィーピーク形状を示し、分析種の保持が最も良好であることがデータからわかりました。これらの優れた性能から、XSelect Premier HSS T3 カラムを選択して、さらに分析法の最適化を行いました。

分析法の最適化では、Empower SSG を使用して、グラジエント時間、強溶媒の割合、温度、流速、強溶媒の種類などのパラメーターを調査しました。このアプリケーションを使用するには、SSG にインポートできる CSV 形式のスプレッドシートを作成する必要があります。プロンプトに従うことで、アプリケーションにより、仕様に合ったサンプルセットが作成されます。これにより、装置メソッドとサンプルセットを個別に作成する際のエラーを低減し、時間を削減できます。

最適化データを分析したところ、アエルギナシンとバエオシスチンに対応する 2 番目と 3 番目のクロマトグラフィーピークが、クリティカルペアとして同定されました。最終的な分析法においては、図 2 からわかるように、これらの 2 化合物が USP 分離度 1.95 まで完全にベースライン分離されました。この結果は、25 ℃ という比較的低いカラム温度、流速 0.75 mL/分、9 分間で 12 ～ 55% メタノールという速めのグラジエント時間を用いることで得られました。メタノールを使用したことで、アセトニトリルの場合と比較して、より良好な保持およびクロマトグラフィー性能が認められました。そのため、「より環境に配慮した」溶媒であるという追加のメリットも考慮して、最終的な分析法にメタノールを選択しました。

ベースラインで測定したクロマトグラフィーの USP 分離度は、すべての既知化合物について 2 に近い値になりました。ピークテーリングは、すべてのピークについて適切であることがわかりました。ノルハルマンは、テーリング係数が 1.5 を超える唯一の化合物でした。MaxPeak HPS テクノロジーを採用した Arc Premier システムおよびカラムで分析した各化合物の分離度およびテーリングを表 1 に示します。

MaxPeak HPS と標準的な表面テクノロジーの比較

MaxPeak HPS テクノロジーの影響を評価するために、標準的なカラムを搭載した標準的なステンレススチール製 ACQUITY Arc システムで同じ分析を実行しました。得られたクロマトグラムを図 3 に示します。この分析における化合物では、標準のステンレススチールの場合と比較して、MaxPeak HPS テクノロジーを使用した場合、クロマトグラフィーピークの高さと面積が増加していました。MaxPeak HPS テクノロジーを使用すると、ノルハルマンのピークの高さと面積が大幅に増加し、テーリングが 2.3 から 1.6 に減少したことが注目されます。

この分析法の 10 回の繰り返し注入を、両方の HPLC 構成で同時に実行しました。この実験の結果を表 2 および表 3 に示します。計算から、このテクノロジーにより、クロマトグラフィーピークの面積と高さの相対標準偏差が小さくなり、より再現性の高い分析法につながることがわかります。

幻覚性キノコに存在する 10 種の化合物を分離するために、ベースライン分離が可能で 15 分という迅速な分析法を作成しました。これらの化合物は医薬品としての可能性が研究されてきており、シロシビン、関連するトリプタミン、β-カルボリンなどが含まれます。この分析法は、XSelect Premier HSS T3 カラムを搭載した Arc Premier HPLC システムで、強溶媒としてメタノールを使用して正常に実行されました。アセトニトリルの代わりにメタノールを使用することにより、はるかに環境に優しい HPLC 分析法になっています。MaxPeak HPS テクノロジーを使用すると、標準的なステンレススチール製 HPLC 構成と比較して、クロマトグラフィー特性全般に大幅な改善が見られました。MaxPeak HPS を使用することにより、クロマトグラフィーピークの面積が最大 426%、高さが最大 882% 増加しました。

1. M. Lauber, T. H. Walter, M. Gilar, M. DeLano, C.Boissel, K. Smith, R. Birdsall, P. Rainville, J. Belanger, K. Wyndham.Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces (HPS).Waters White Paper.2023, 720006930.
2. R. Irizarry, A. Winczura, O. Dimassi, A. Minhas, J. Larice.Psilocybin as a Treatment for Psychiatric Illness: A Meta-Analysis. Cureus.2022, 14(11): e31796.
3. W. R. Smith, P. S. Appelbaum.Two Models of Legalization of Psychedelic Substances.JAMA.2021, 326(8): 697–698.
   
4. M. W. Beug, J. Bigwood.Psilocybin and Psilocin Levels in Twenty Species From Seven Genera of Wild Mushrooms in the Pacific Northwest, U.S.A. Journal of Ethnopharmacology.1982, 5(3): 271–285.
   
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