一种分离和检测致幻蘑菇中裸盖菇素、相关色胺类和β-咔啉类化合物的方法

致幻蘑菇近来因其在疾病治疗中的应用而受到关注。研究人员在这些蘑菇中发现了两类活性化合物：色胺（包括裸盖菇素）和β-咔啉（一类已知的抗抑郁药）。本研究的目的是使用一种色谱方法分离一组六种色胺和四种β-咔啉类化合物。这些化合物充当路易斯碱，已知会与标准不锈钢HPLC系统中的金属氧化物层发生相互作用。MaxPeak高性能表面(HPS)技术已被证明可以解决分析物与金属氧化物相互作用的相关问题¹。 从色谱结果中可以看出，峰面积和峰高分别增加了高达426%和882%。本文介绍了一种使用Arc™ Premier系统结合Empower™样品组生成器(SSG)和XSelect™ Premier HSS T3色谱柱分离一组10种色胺和β-咔啉类化合物的方法。  

优势

• 与标准不锈钢HPLC系统相比，使用MaxPeak HPS技术可显著改善色谱性能
• 一种更加绿色环保的方法，使用更环保的甲醇作为强溶剂开发
• 一种仅需15 min即可使一组色胺和β-咔啉类化合物实现基线分离的方法
• 使用Empower样品组生成器快速创建仪器方法和样品组

近年来，对致幻蘑菇中所含化合物的研究重新成为焦点。大多数研究都集中在色胺裸盖菇素的药用价值上，特别是它在治疗峰簇性头疼、焦虑、抑郁、强迫症、创伤后应激障碍和药物滥用等疾病方面的应用²。 这些蘑菇除具有药用价值外，它们在某些地区的娱乐用途的合法化也呈上升趋势³。

在食用生蘑菇时，实现正确的剂量控制相当困难，因为不同属、种、变种以及生长条件下的蘑菇中，活性化合物的含量差异很大⁴。 此外，有零星报道称，食用致幻蘑菇后会出现肌无力等不良反应，这种效应据推测是由裸盖菇素的相关色胺之一“铜绿菌素”引起的⁵。 这些蘑菇中所含的β-咔啉类化合物是一种单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。MAOI通常用作抗抑郁处方药，但它也会影响色胺的代谢⁶。 这种化合物混合物可能产生的协同效应（有利和有害）尚未经过充分研究。为了促进临床研究的开展，以及确保用药的安全性和准确性，需要一种简单快速的方法来分离这些化合物。

本文所述研究开发了一种用于分离10种色胺和β-咔啉类化合物的HPLC方法。这些化合物的化学结构如图1所示。在方法开发过程的优化步骤中，使用Empower SSG自动创建仪器方法。至关重要的是，利用Waters™ MaxPeak HPS技术可大幅降低分析物与金属氧化物发生相互作用的相关风险。 

样品描述

裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素购自Sigma Aldrich（德国达姆施塔特），分别溶于1:1乙腈:水中。4-磷酰氧基-N-甲基色胺、铜绿菌素、4-磷酰氧基色胺、去甲脱磷酸裸盖菇素、哈尔满、哈尔明、去甲哈尔满、去甲骆驼蓬碱均购自Caymen Chemicals（美国密歇根州）

使用标准品制备一组色胺和β-咔啉类化合物，模拟致幻蘑菇中的活性化合物。这些化合物通常使用甲醇提取⁷。 为反映这一点，使用5%水、5%乙腈和90%甲醇制备一组包含所有10种化合物的样品，裸盖菇素、脱磷酸裸盖菇素、4-磷酰氧基-N-甲基色胺、铜绿菌素、4-磷酰氧基色胺、去甲脱磷酸裸盖菇素和去甲骆驼蓬碱的浓度为0.05 mg/mL，哈尔满、哈尔明、去甲哈尔满的浓度为0.025 mg/mL。

方法开发

在方法开发过程中筛选了四种选择性各不相同的色谱柱，分别是：XBridge™ Premier BEH C₁₈、XSelect Premier CSH C₁₈、XSelect Premier CSH苯己基和XSelect Premier HSS T3。所有色谱柱的尺寸均为2.5 μm，4.6 x 100 mm。筛选过程中同时使用了PDA和QDa质谱检测器进行峰鉴定。数据表明，分析物在XSelect Premier HSS T3色谱柱上获得的色谱峰形和保留性均更好。由于XSelect Premier HSS T3色谱柱表现出优异的性能，因此选择该色谱柱用于进一步的方法优化。

方法优化步骤利用Empower SSG研究梯度时间、强溶剂百分比、温度、流速和强溶剂类型等参数。使用此应用程序时，用户必须创建一个可以导入SSG的CSV电子表格。按照提示操作后，应用程序将按照设定的规格创建样品组。这样可以降低单独创建仪器方法和样品组时的出错率并节省时间。

分析优化数据时，将代表铜绿菌素和4-磷酰氧基-N-甲基色胺的第二个和第三个色谱峰鉴定为关键分析物对。在最终方法中，这两种化合物实现了基线分离，USP分离度为1.95，如图2所示。该方法使用相对较低的柱温25 °C，流速为0.75 mL/min，梯度时间更短，甲醇在9 min内从12%增加至55%。使用甲醇与使用乙腈相比，得到了更出色的保留性和色谱性能，此外，甲醇还是一种更加绿色环保的溶剂，因此被选择用于最终方法。

所有已知化合物在基线处测得的USP色谱分离度值均接近2。研究发现，所有峰的峰拖尾均满足要求，仅去甲哈尔满化合物的拖尾因子大于1.5。表1列出了每种化合物在采用MaxPeak HPS技术的Arc Premier系统和色谱柱上得到的分离度和拖尾因子。

MaxPeak HPS与标准表面技术

为评估MaxPeak HPS技术的影响，在配备标准色谱柱的标准不锈钢ACQUITY Arc系统上运行了相同的分析，所得的色谱图见图3。与标准不锈钢相比，使用MaxPeak HPS技术时，此分析中化合物的色谱峰高和峰面积都有所增加。值得注意的是，使用MaxPeak HPS技术时，去甲哈尔满的峰高、峰面积显著增加，拖尾因子从2.3降至1.6。

我们在两种HPLC配置上使用该方法运行了十次重复进样。实验结果见表2和表3。计算结果表明，该技术可以降低色谱峰面积和峰高的相对标准偏差，从而提高方法的重现性。

我们开发出一种在15分钟内快速完成基线分离的方法，用于分离致幻蘑菇中的10种化合物。这些化合物的药用价值近来受到研究人员的广泛关注，包括裸盖菇素、相关色胺类和β-咔啉类化合物。该方法已在配备XSelect Premier HSS T3色谱柱的Arc Premier HPLC系统上以甲醇作为强溶剂成功运行。使用甲醇代替乙腈提供了一种更加环保的HPLC方法。与标准不锈钢HPLC配置相比，使用MaxPeak HPS技术时观察到一般色谱性质有显著改善。使用MaxPeak HPS使色谱峰面积和峰高分别增加高达426%和882%。

1. M. Lauber, T. H. Walter, M. Gilar, M. DeLano, C.Boissel, K. Smith, R. Birdsall, P. Rainville, J. Belanger, K. Wyndham.基于MaxPeak高性能表面(HPS)的低吸附HPLC色谱柱。沃特世白皮书。2023, 720006930ZH.
2. R. Irizarry, A. Winczura, O. Dimassi, A. Minhas, J. Larice.Psilocybin as a Treatment for Psychiatric Illness: A Meta-Analysis. Cureus.2022, 14(11): e31796.
3. W. R. Smith, P. S. Appelbaum.Two Models of Legalization of Psychedelic Substances.JAMA.2021, 326(8): 697–698.
   
4. M. W. Beug, J. Bigwood.Psilocybin and Psilocin Levels in Twenty Species From Seven Genera of Wild Mushrooms in the Pacific Northwest, U.S.A. Journal of Ethnopharmacology.1982, 5(3): 271–285.
   
5. A. Sherwood, A. Halberstadt, A. Klein, J. McCorvy, K. Kaylo, R. Kargbo, P. Meisenheimer.Synthetic and Biological Evaluation of Tryptamines Found in Hallucinogenic Mushroom: Norbaeocystin, Baeocystin, and Aeruginascin.J Nat Prod 2020, 83: 461–467.
   
6. F. Blei, S. Dorner, J. Fricke, F. Bladeweg, F. Trottmann, A. Komor, F. Meyer, C. Hertweck, D. Hoffmeister.Simultaneous Production of Psilocybin and a Cocktail of B-Carboline Monoamine Oxidase Inhibitor in “Magic” Mushrooms.Chem Eur J.2020, 26: 729–734.
   
7. C. Lenz, J. Wick, D. Hoffmeister.Identification of ω-N-Methyl-4-hydroxytryptamine (Norpsilocin) as a Psilocybe Natural Product.J Nat Prod.2017, 80: 2835–2838.