• 应用纪要

在环保型GlycoWorks™ RapiFluor-MS™标记的N-糖样品制备中用DMSO替代DMF

在环保型GlycoWorks™ RapiFluor-MS™标记的N-糖样品制备中用DMSO替代DMF
  • Stephan M. Koza
  • Balasubrahmanyam Addepalli
  • Caitlin M. Hanna
  • Matthew A. Lauber
  • Steve Shiner
  • Waters Corporation
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摘要

欧盟欧洲化学品管理局2023年关于使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的限制文件中强调，DMF对使用者和环境而言的风险明显高于二甲基亚砜(DMSO)。因此，本文介绍了在快速GlycoWorks N-糖分析流程的RapiFluor-MS标记反应步骤和最终样品稀释步骤中，用DMSO有效替代DMF用作助溶剂的方法。本文展示了低唾液酸化水平的单克隆抗体，以及具有高度天线性和多重唾液酸化N-寡糖的牛胎球蛋白的N-糖谱分析结果。此外，本文还重点介绍了在GlycoWorks流程中使用DMSO时的一些注意事项。

优势

使用DMSO代替DMF的更安全、更环保的GlycoWorks快速N-糖样品前处理流程。

简介

Waters™ GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖标记试剂盒（例如用户指南715004903EN）提供了一种快速简便的方法，能够标记游离N-糖，以进行灵敏的荧光和质谱检测（图1）。该流程包括PNGase F快速释放N-糖，然后用RapiFluor-MS (RFMS)标记得到的糖胺。然后通过定量HILIC-SPE纯化步骤从RFMS标记的N-糖中去除反应副产物。整个过程需要1~2小时，具体取决于样品数量，可选择使用手动或自动流程，适用于各种样品1-3。

在2015年发布的初始版本中，研究人员发现，在乙腈:水混合物中，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为RFMS标记N-糖的样品助溶剂可提供优势。因此，在最终样品中使用DMF作为共溶剂，并使用无水DMF溶解RFMS标签。使用无水溶剂溶解RFMS至关重要，因为水可以与RFMS反应。

但是，随着人们对DMF可能对分析人员和环境带来的不良影响认识的深入了解，以及欧盟欧洲化学品管理局(echa.europa.eu)于2023年12月对DMF使用的限制，研究人员对一种采用DMSO一对一替代DMF的GlycoWorks流程进行了评估。本总结将重点比较在RFMS标记步骤中使用无水DMF或DMSO，以及使用试剂级DMF或DMSO作为N-糖（RFMS标记并经HILIC SPE纯化）的助溶剂时的GlycoWorks流程。

图1.图中突出显示了Waters GlycoWorks RapiFluor-MS方案。DMF或DMSO在RFMS标记步骤（步骤2）需要作为助溶剂，以及在SPE纯化后用于样品稀释（步骤3）。步骤2需要无水溶剂，而步骤3则不需要无水溶剂。

实验

GlycoWorks样品前处理和分析步骤按照用户指南720005470EN和715004903EN中概述的步骤进行。其他相关详细信息随所示数据一起提供。 

结果与讨论

RFMS标记和标记的N-糖样品稀释

RFMS标记步骤中有三个注意事项。首先，标记流程的产量应最大化，并且不应区分不同糖型。此外，应尽量避免过度标记，或者说尽可能避免生成带有多个标记的N-糖。之前的研究已经证明了通过GlycoWorks RFMS流程使用无水DMF溶解RFMS时获得的N-糖谱的准确性1，且使用无水DMSO代替DMF获得了相当的标记结果（图2）1。本研究使用无水DMSO或DMF溶解RFMS试剂，对单克隆抗体(NISTmAb™)和牛胎球蛋白混合物进行了分析。这种糖蛋白混合物用于涵盖各种N-糖，范围从mAb中丰度更高的低天线性中性形式，到胎球蛋白中存在的高天线性、高度唾液酸化的形式。值得注意的是，图2中比较的样品在HILIC分析之前未经HILIC-SPE纯化，因此无法更清楚地确定标记步骤中的任何差异。

在标记流程中使用DMSO也产生了相对较低水平的过度标记N-糖（图3）。这一点通过LC-MS分析完整单克隆抗体标准品（P/N：186006552-1）生成的单标记和双标记主要FA2糖型得到了证明。使用HILIC-SPE纯化这些样品，得到的水相样品在HILIC分析之前用含有相应助溶剂的溶液稀释（请参阅用户指南715004903EN），以尽可能地提高痕量级双标记FA2游离寡糖的LCMS检测能力。

图2.NISTmAb (NIST RM 8671)和牛胎球蛋白(Sigma-Aldrich PN:F3004)混合物（每种大约1 mg/mL）的HILIC-FLR N-糖谱，每个游离寡糖包含0到5个唾液酸(S0~S5)。样品依据用户指南720005470EN使用RapiGest™进行变性处理，通过PNGase F进行去N-糖基，并用溶于DMF或DMSO中的RFMS进行标记。使用ACQUITY™ Premier UPLC™ BEH™ Amide, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 × 50 mm游离寡糖分析专用柱（P/N：186004740）对1 µL粗制样品进行直接HILIC分析，流速为1.0 mL/min，分析梯度为10分钟。其他条件请参见用户指南715004903EN。
图3.沃特世完整单克隆抗体标准品（P/N：186006552-1）的HILIC-MS (Vion™ Q-ToF)分析，使用DMF或DMSO进行N-糖RFMS标记和最终样品稀释步骤，确定RFMS过度标记的程度。过度标记是基于双标记FA2 (m/z 1044.023)的提取离子强度(EIC)来确定的。使用ACQUITY Premier UPLC BEH Amide, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm游离寡糖分析专用柱（P/N：186009524）进行分离，流速为0.4 mL/min，分析梯度为35分钟。其他条件请参阅用户指南715004903EN

RFMS标记N-糖样品的稳定性和上样

经过HILIC SPE纯化步骤（请参阅用户指南720005470EN和715004903EN）后，得到含90 µL样品的水相缓冲液。为了尽可能多地将该样品上样至酰胺基HILIC分析柱，使用310 µL的DMF:ACN 32:68 (v:v)混合溶液稀释样品。此处使用DMF作为助溶剂来提高样品稳定性。但是，建议在24小时后再重新混合样品，然后再执行分析（用户指南715004903EN）。

观察结果表明，在样品稀释步骤中，DMSO可以有效替代DMF，但是，用DMSO:ACN混合溶液稀释的样品上样至酰胺基HILIC分析柱时，发生强溶剂效应的可能性略高。在本研究中，前文的标记研究中使用的NISTmAb和牛胎球蛋白混合物中的RapiFluor-MS标记N-糖经过HILIC SPE纯化，并在HILIC分析之前用含有相应助溶剂的溶液进行稀释。如图4所示，当对于多种N-糖的标记和样品稀释流程中使用DMF或DMSO时，获得了相当的HILIC谱图。此外，三种选定糖型（中性(FA2)、三唾液酸化(A3G3S3)和四唾液酸化(A3S1G3S3) N-糖）的定量的相对丰度一致。

图4.展示了NISTmAb (NIST RM8671)和牛胎球蛋白混合物中三种选定糖型的HILIC-FLR N-糖谱及其相对丰度（n = 3，误差条为1个SD）。样品前处理遵循用户指南720005470EN，使用DMF或DMS溶解RFMS，并作为SPE纯化样品稀释剂的组分。进样体积为4 µL。其他实验详细信息请参见图2。

实验还观察到，经DMF和DMSO稀释的样品在6 °C下24小时内的稳定性相当（图5）。然而，使用任一种助溶剂时，观察到稀释剂中的中性N-糖在24小时后对HILIC分析柱表现出强溶剂效应，但该效应未对定量产生显著影响。HILIC分离中的强溶剂效应会导致弱保留分析物发生谱带展宽，这是由于破坏了填充颗粒表面的水层，且该效应会因进样体积增大和样品基质极性增强而加剧。这一特定观察结果可能是由于小填充床体积(2.1 × 50 mm)酰胺基HILIC色谱柱上4 µL的进样体积，再加上样品中的非极性ACN组分发生选择性蒸发损失所致。 

图5.在6 °C下，NISTmAb和牛胎球蛋白混合物的HILIC-FLR N-糖谱以及选定相对丰度（n = 2，误差条为范围）的初始和24小时样品稳定性时间点。样品前处理和分析如图4所示。有关中性游离寡糖(FA2)峰形变化的讨论，请参阅正文。

实验中还观察到，与DMF相比，稀释剂中含有DMSO的样品观察到的强溶剂效应略强（图5）。这可能是由于DMSO的极性略强（其介电常数为47.2，而DMF为38.3），以及样品中助溶剂的浓度较高(25% v/v)。这种差异的影响在图6中清晰可见，其中进样体积大于5 µL会导致DMSO稀释的中性糖型产生更明显的峰肩。强溶剂效应会随着进样体积的增加或柱体积的减小而出现。大多数情况下，在样品稀释剂中使用DMSO不会有问题，但在HILIC方法中，进样体积可能需要适当减少。

图6.在图4和图5的分析样品中，一系列进样体积下的强溶剂效应。经DMSO稀释的样品中，谱带展宽和峰分裂更为明显。 

结论

研究发现，在Rapifluor-MS N-糖GlycoWorks流程中，DMSO可以“一对一”有效替代DMF，用作溶剂和助溶剂。鉴于我们对DMF为实验室安全及环境带来的潜在负面影响有了更深入的了解，尤其是在其使用限制日益增加的背景下，我们特此撰写了本研究。 

研究结果表明，无水DMSO在RapiFluor-MS以及随后的RFMS标记中的溶解作用相当。研究还发现，DMSO还可作为RFMS标记和HILIC SPE纯化N-糖样品稀释剂的有效组分。但是，与使用DMF稀释的样品相比，使用DMSO稀释的样品进行酰胺基HILIC分析时，最大进样体积略有减少。因此，使用DMSO作为稀释剂组分时，可能需要适当减少进样体积。

为进一步证明使用DMSO替代DMF时RFMS GlycoWorks方法的可靠性，我们使用DMSO溶解了RFMS，并同时将DMSO用作HILIC样品稀释剂的组分，成功开发出了一套自动化流程 4。该流程包含一个透析步骤，用于在不兼容的基质进行样品的缓冲液置换，并在执行RapiFluor-MS GlycoWorks流程之前浓缩样品。

参考资料

  1.  Lauber, M. A.; Yu, Y.-Q.; Brousmiche, D. W.; Hua, Z.; Koza, S. M.; Magnelli, P.; Guthrie, E.; Taron, C. H.; Fountain, K. J. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent That Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.Anal Chem.2015, 87 (10), 5401–5409.
  2. Koza, S. M.; McCall, S. A.; Lauber, M. A.; Chambers, E. E. Quality Control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation.Waters Application Note 720005506, May 2016.
  3. Zhang, X.; Reed, C. E.; Birdsall, R. E.; Yu, Y. Q.; Chen, W. High-Throughput Analysis of Fluorescently Labeled N-Glycans Derived from Biotherapeutics Using an Automated LC-MS-Based Solution.SLAS Technology.2020, 24 (4), 380-387.
  4. Hanna, C.M.; Koza, S. M., Yu, Y. Q. Automated RapiFluor-MS™ Labeled N-Glycan Sample Preparation for Protein A Purified Monoclonal Antibodies.Waters Application Note 720007854, February 2023.

特色产品

720008157ZH，2023年12月

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