• 应用纪要

使用USP通则<621>《色谱法》中允许的新液相色谱梯度调整和Alliance™ iS HPLC System完成方法现代化改进

使用USP通则<621>《色谱法》中允许的新液相色谱梯度调整和Alliance™ iS HPLC System完成方法现代化改进
  • Catharine Layton
  • Paul D. Rainville
  • Waters Corporation
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供体外诊断使用。仅在部分国家/地区销售。

摘要

美国药典(USP)通则<621>《色谱法》中定义了在不从根本上修改药典分析程序的情况下，各种色谱测试参数可以调整的程度。在本应用简报中，我们将通则中所述的梯度方法调整与Alliance™ iS HPLC System相结合，对USP抗病毒药物硫酸阿巴卡韦分离各论中的色谱柱尺寸和系统进行现代化改进。 

优势

  • 与Alliance iS HPLC System搭配使用时，美国药典通则<621>《色谱法》允许的梯度方法调整可生成符合法规要求的优质数据
  • Alliance iS HPLC System的色谱反压限制范围更宽，可使用一系列现代色谱柱尺寸提供高效分离，从而减少运行时间、进样体积和溶剂消耗

简介

美国药典(USP)解决方案组合可用于质量保证，增强监管的可预测性，并帮助制造商分销优质药品、膳食补充剂和食品。2022年12月1日，发布了通则<621>《色谱法》的整合标准。该标准结合了USP与《欧洲药典》(EuPh)第2.2.46节《色谱分离技术》和《日本药典》(JP)第2.01节《液相色谱》的内容。整合这些监管指南后，可以使用现代化色谱工具，无需重新验证完整各论，使方法更具灵活性。

色谱分离受到色谱柱硬件和系统硬件的影响。这些参数对方法性能至关重要，各论方法经过验证后，灵活性受到限制。例如，现代HPLC色谱柱硬件的直径通常为4.6 mm，使用各种新的固定相取代基，而5 µm HPLC粒径被≤3.5 µm粒径所取代，以在更短的时间用更少的溶剂实现类似的分离。现代HPLC系统，如Alliance iS HPLC System（图1），具有高色谱分离效率、直观的触摸屏界面、免工具色谱柱接头和更宽的HPLC操作反压限制范围，在调整各论方法时提供可靠的灵活性，适合现代色谱柱硬件尺寸。

图1.配备可变波长紫外检测器的Alliance iS HPLC System

在本应用纪要中，我们采用通则<621>《色谱法》中允许的梯度方法调整，对代表性USP各论方法的色谱柱和系统进行现代化改进（表1）。

表1.在不从根本上修改药典分析程序的情况下，各种色谱测试参数可以调整的程度如表中所述。红色方框指示本应用纪要关注的参数。

选择抗病毒化合物硫酸阿巴卡韦的杂质分离分析是因为，经验证的梯度方法在该分析中生成一对具有挑战性、部分分离的关键峰，色谱系统的适用性标准正是基于此。执行USP <621>中允许的几项有助于使用现代化硬件的梯度系统调整后，检查得到的色谱图是否能够满足原始各论方法的系统适用性要求。

材料与方法

USP各论：

硫酸阿巴卡韦，有机杂质

液相色谱系统：

配备可变波长紫外(TUV)检测器的Alliance iS HPLC System

色谱柱：

Symmetry™ C18色谱柱, 3.9 x 150 mm, 5 µm, P/N: WAT046980

Symmetry C18色谱柱, 4.6 x 150 mm, 5 µm, P/N: WAT045905

Symmetry C18色谱柱, 4.6 x 100 mm, 3.5 µm, P/N: WAT066220

XBridge™ C18色谱柱, 4.6 x 100 mm, 3.5 µm, P/N: 1860033

XSelect™ HSS™ T3色谱柱, 4.6 x 150 mm, 3.5 µm, P/N: 186004786

软件：

Empower™ 4 FR 5色谱数据系统(CDS)

样品：

硫酸阿巴卡韦系统适用性混合物(P/N: 1000500, USP)

结果与讨论

采用系统性策略对USP硫酸阿巴卡韦分离各论进行现代化改进。第一步，确定各论方法使用的色谱柱：L1固定相取代基与5 µm粒径和3.9 x 150 mm色谱柱硬件。选择直径4.6 mm，柱长(L) 100 mm和150 mm的现代色谱柱硬件，搭配L1固定相取代基，执行方法现代化。色谱柱的固定相替代基粒径为5 µm或3.5 µm (dp)。任何情况下，USP <621>指南允许L/dp比在专论方法的-25%至+50%之间。

根据USP <621>指南中提供的公式，用数学方法调整现代目标色谱柱的流速、进样体积和梯度开始时间。首先，公式1通过调整流速来维持各论分离的线性流速。其次，根据公式2调整进样体积以保持分析物与柱体积的比率。最后，根据计算的目标色谱柱流速、长度和粒径（表2），利用公式3调整梯度开始时间。开始时间调整保留了各论分离中报告的梯度斜率与柱体积比。USP <621>指南提供了公式4，允许调整系统延迟体积（如果在各论验证期间有指定）。硫酸阿巴卡韦各论中未报告系统延迟体积，且分离过程不包括初始等度保持时间。因此，在方法现代化改进过程中，系统延迟体积调整未应用于计算的梯度开始时间。

公式1.各论色谱柱和4.6 × 100 mm, 3.5 µm色谱柱的流速调整
公式2.各论色谱柱和4.6 x 100 mm, 3.5 µm色谱柱的进样体积调整
公式3.各论色谱柱和4.6 x 100 mm, 3.5 µm色谱柱的梯度调整
表2.带乘数的梯度时间调整。
公式4.各论仪器的延迟体积调整（如果有）

使用沃特世OBD制备级方法转换计算器和方法转换计算器2.0（图2）确认目标色谱柱的手动梯度计算。在线计算器特别重要，因为它们能够为调整后的梯度估计最大梯度反压。尽管这一估计是针对100%有机流动相组成，而不是各论中的85%有机相组成计算的，但增加了对调整后的方法不会超过Alliance iS HPLC System10,000 psi反压限制的信心。

图2.沃特世OBD制备级方法转换计算器和方法转换计算器2.0在线方法调整计算器(www.waters.com)。 

使用调整后的梯度和现代化色谱硬件分析了各论方法的系统适应性杂质混合物(SST)。对于所有现代色谱柱尺寸，未分离的阿巴卡韦关键峰对成功达到NLT 1.5的各论系统适用性分离要求（图3）。将SST相对保留时间(RRT)与用于初始各论分离的固定相生成的相对保留时间进行比较时，相同L1固定相取代基的色谱柱表现最相似，而不同L1固定相取代基的RRT有所不同（图4）。如USP <621>中所述，使用各种取代基可能会观察到峰缺失和/或反转，因此在通过替代系统上的PDA谱图分析进行方法调整后鉴定色谱峰。

图3.各论和调整后的色谱柱的叠加色谱图
图4.系统适用性混合物杂质的相对保留时间(RRT)比较

Alliance iS HPLC System与现代化色谱柱硬件尺寸相结合，为经验证的各论分离提供了特有的优势。与反压限制仅为5,000 psi的传统HPLC系统相比，采用现代化管路直径的LC系统有利于使用分离反压高达10,000 psi的色谱柱硬件。此外，在保留USP <621>指南L/dp比要求的同时，各论方法的粒径从5 µm成功降至3.5 µm。这些硬件组合显著减少了经验证的各论分离的运行时间、进样体积和溶剂消耗（表3）。

表3.搭配Alliance iS HPLC System使用时，现代化色谱柱硬件带来的好处

结论

根据通则<621>《色谱法》（2022年12月1日），可以成功调整USP各论的梯度分离，以维持Alliance iS HPLC System的系统适用性验收标准。Alliance iS HPLC System具有直观的触摸屏界面，简单易用，可在不影响经验证的各论系统适用性的情况下实现色谱柱现代化。该硬件提供了支持各种现代HPLC色谱柱直径的操作反压限制，可以观察到特有的色谱优势，例如节省了运行时间、进样体积和溶剂。 

参考资料

  1. General Chapter <621> Chromatography, Official Date: 01-Dec-2022, www.USP.org, referenced 01/06/2023.
  2. Abacavir Sulfate Monograph official 01-May-2020, www.uspnf.com, referenced 01/06/2023.
  3. OBD制备级方法转换计算器, www.waters.com, 访问日期01/06/2023.
  4. 方法转换计算器2.0, www.waters.com, 访问日期01/06/2023.

特色产品

720007865ZH，2023年2月

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