使用生物兼容性二元液相色谱系统进行肽图分析：评估沃特世与竞争厂商液相色谱系统的保留时间精度以及混合效应

完全生物兼容的液相色谱系统装配有二元高压混合溶剂输送系统，可产生高精度结果，同时保持运行生物分子方法的灵活性，这些方法需要一款耐腐蚀系统以便运行高盐浓度应用。本应用纪要重点关注肽图分析应用中典型的挑战性方法条件对结果有何影响，这些条件包括低流速以及有机相组成随时间推移仅发生微小变化。对于多数液相色谱系统，这种方法条件组合可能导致保留时间的变化幅度较大，基线噪音较高，部分原因在于系统混合行为的效率低下。使用二元生物兼容性ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统获得的数据表现出高水平重现性，这是保障数据准确可靠的一项关键属性。此外，采用专门设计的混合器，以兼容包含三氟乙酸的流动相，可显著降低基线噪音，改善信噪比，从而提高分析灵敏度。除ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio二元系统以外，还评估了另外两款竞争厂商的液相色谱系统（均装配有二元高压混合泵）对保留时间重现性和基线噪音的影响。 

优势

• 在挑战性方法条件下获得可重现的保留时间
• 灵活适用于多种生物分子应用，系统性能始终维持高水平
• 混合选件可降低基线噪音并提高灵敏度

完全生物兼容的二元液相色谱系统能够灵活运行可能需要使用耐腐蚀流路的生物分子方法，同时继续为挑战性方法提供高水平的梯度精度。肽图分析方法代表一类在梯度精度和进样间重现性方面可能具有挑战性的方法，因此是考察新型ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio二元系统性能的理想应用。本应用纪要重点关注泵性能的两个主要方面，即梯度输送的重现性（通过多次进样的保留时间精度来衡量）和混合效率（通过计算噪音和信噪比来衡量）。 

已有研究表明，在某些方法条件下，与二元和三元混合泵等低压混合泵相比，高压混合二元泵的溶剂输送机制具有更高的梯度精度。这些方法条件包括低流速以及梯度组成随时间推移仅发生微小变化，通常称为缓梯度¹。有多种应用领域需要使用这些缓梯度条件，其中较为常见的是肽图分析。蛋白质酶解可能生成复杂多肽混合物，通常需要在低流速的缓梯度条件下才能获得高分离度，使各种肽得到分离以实现鉴定和/或定量目的。即使使用高压二元混合泵，这些严苛的编程方法也难以提供良好的重现性。由于肽洗脱对有机相组成的细微变化非常敏感，因此过去观察到的梯度组成输送的批间和批内变异性表现为不同进样之间的保留时间变异。

为实现梯度重现性，还务必确保系统混合充分且可重现，尤其是在高压混合系统中，此类系统在混合器合并来自各流路的液流。如果混合不可重现，会导致不同进样间输送至分析柱的流动相组成略有不同，可能会观察到保留时间差异或变异性。此外，如果肽分析方法需要使用UV截止波长值低的添加剂（例如三氟乙酸），由于混合不充分而导致的任何流动相组成不均都可能表现为基线“波动”、升高或不可重现。添加剂和数据采集所需波长(214 nm)会影响方法结果。尤其是对于微量杂质，目标峰保留时间附近基线的任何“凹陷”或“凸起”都会对峰积分和峰面积产生显著影响，导致定量结果不可靠。如果色谱峰在基线的不稳定区域流出，将难以确定峰的起点和终点。也就是说，色谱峰的一部分可能低于基线，因此积分面积可能并非真实峰面积，导致定量结果不准确和/或不一致。此外，对于强度较小的峰，混合不充分的影响更为严重。本应用纪要探讨了不同液相色谱系统中梯度输送精度和混合效率的影响。

样品描述

本研究使用沃特世单克隆抗体胰蛋白酶酶解物标准品（部件号：186009126）。使用100 µL 0.1%三氟乙酸水溶液（流动相A）复溶该标准品。空白进样使用相同的0.1%三氟乙酸水溶液（流动相A）。 

肽分析方法的重现性受单位时间或色谱柱体积内梯度组成变化的影响。本研究运行了两种方法以展示这种影响。第一种方法使用0.5 mL/min的流速，梯度为在23.4 min内从99:1变为40:60，相当于单位色谱柱体积内溶剂B变化约1%。第二种方法使用0.2 mL/min的流速，梯度为在93.4 min内从99:1变为60:40，相当于单位色谱柱体积内溶剂B变化约0.5%。 

方法1结果 – 较高流速和较短梯度对保留时间精度的影响

方法1（0.5 mL/min和23.4 min的梯度）是一种相对“容易”的梯度，由于流速较高且梯度斜率较小，因此泵可以可靠地输送溶液。该方法要求泵在23.4分钟内完成39%的组成变化，或每分钟改变1.7%。二元泵通过调整泵A和泵B的相对流速来改变梯度组成。在本例中，泵A的流速相对于总流速降低了1.7%，或每分钟降低约8.5 µL。而泵B的流速提高相同的量，使所得流速始终为0.5 mL/min。如上所述，评估流量输送精度的一种简单方法是，观察多次进样所得的保留时间。图1所示为使用新型ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio二元系统，以方法1的典型分析条件运行6次重复进样得到的叠加图。   

从图中可以看出，保留时间非常一致。为更深入地理解数据，选择涵盖整个梯度的八个峰以监测梯度输送的精度。在六次重复进样中，八个标记峰的平均保留时间变化仅为0.16秒。比较在沃特世生物兼容性二元系统上获得的结果与在两款竞争厂商液相色谱系统（同样使用二元泵进行梯度输送）上运行相同方法获得的结果，发现它们的性能相似（表1）。 

在考察的所有系统中，观察到的峰保留时间变化都不超过0.4秒。虽然系统性能大致相同，但由于仪器的混合方式、系统体积及其他设计因素等不同，因此在选择性方面略有差异（数据未显示）。同样，运行采用典型的分析流速和较陡的梯度的方法时，所有系统的性能相似。 

方法2结果 – 较低流速和较长梯度对保留时间精度的影响

方法2代表更具挑战性的方法条件，流速降至0.2 mL/min，梯度为在约93分钟从99:1变为60:40。使用泵运行长时间可重现的梯度可能非常困难，即使对于高压二元混合系统也是如此。梯度程序在93分钟内完成39%的组成变化，大约相当于每分钟2.4%的组成变化。2.4%的变化相当于每个泵头每分钟的流速仅改变4.8 µL，约为第一个示例所示µL变化的½。因此需要非常高的流速精度水平才能在多日多次进样中获得相同的结果。图2所示为在Waters Bio二元液相色谱系统上使用方法2进行6次重复进样获得的结果。 

与方法1一样，从所得色谱图可以看出，结果具有良好的重现性。确定八个标记峰的平均保留时间标准偏差为1.5秒。重申一下，由于方法2采用的分析条件更具挑战性，因此这一偏差的增加并不意外。与在两套竞争厂商系统上采用相同方法获得的结果相比，沃特世系统显然在整个梯度范围内提供了更高的梯度输送重现性（表2）。 

请注意，对于竞争产品B，在采集的6次重复进样结果中，有两次进样存在问题，导致数据发生偏离。一次进样在梯度早期表现出高变异性（影响峰1和2），另一次进样则在梯度结束时表现出高变异性（影响峰7和8）。这种不一致还会影响色谱分析的选择性和峰分离度，并可能给峰的准确鉴定和定量带来挑战（数据未显示）。要生成可靠的样品数据，必须采用能够为每次进样提供可靠、精确的方法条件的系统。 

混合器体积对基线噪音的影响

上文简要提到，溶剂混合对于生成高质量结果也具有重要作用。溶剂在输送至分析柱之前的混合效率低下或混合不完全也是造成不同进样间保留时间变化的部分原因。使用TFA有助于识别任何混合效率低下的情况，通常见于基线中。关于每套系统的混合行为，方法1使用系统随附的小体积混合器，因为较快的流速和较陡峭的梯度可降低混合不充分引起的基线波动的影响。表3显示了在三种评估的系统中，执行空白进样时三个梯度区域的峰到峰噪音实测值。   

数据表现出两个关键趋势：首先，所有系统在梯度早期均观察到较高的噪音值；其次，所有系统使用上述方法条件时计算出的噪音结果非常相似。 

为解决基线问题，对于需要使用TFA的应用，液相色谱供应商通常制造并推荐使用大体积混合器，以便使基线平坦，并提供一致的色谱图，从而改善积分以及定量重现性和准确度并提高信噪比。此外，随着流速降低和/或梯度斜率减小，均匀混合变得更具挑战性。 

色谱图清晰展示了在使用TFA的应用中推荐采用大体积混合器的原因：它可以提供明显更平滑的基线。当使用默认的小体积混合器时，基线噪音非常明显，可能对峰积分和定量产生不利影响，并降低目标峰的总体信噪比。除肉眼可见的改善以外，表4显示，使用大体积TFA混合器可显著降低（超过3倍）实测噪音值，尤其是在最容易观察到混合效应的梯度早期。 

为凸显基线噪音下降时的信噪比改善，考察了梯度早期流出的一个小峰。从50 µL标准体积混合器更换为推荐的340 µL混合器后，五次重复进样的平均信噪比由1.9增加至5.1（图4）。不仅提高了对低含量峰的检测能力，而且能够以更可靠且重现性更高的方式进行积分和定量。需要注意的是，改变混合器的体积将导致系统体积改变，从而导致峰保留时间发生改变（图4）。 

客户对于生物兼容性系统的需求越来越高，这些系统在任何方法条件下都能提供可靠且准确的数据。新型完全生物兼容的二元系统能够灵活运行使用耐腐蚀流路的方法，同时继续为挑战性肽图分析方法提供高水平的梯度精度。与另外两款二元UHPLC系统相比，ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio二元系统能够为具有挑战性的肽分析方法提供高度可重现的保留时间。此外，在TFA应用中使用大体积混合器可显著改善基线，从而提高鉴定、积分和定量色谱峰的能力。 

1. Simeone J, Hong P, McConville P. Performance of the ACQUITY UPLC I-Class PLUS System for Methods which Employ Long, Shallow Gradients.Waters Application Note, 2007 Nov, 720002393en.