简化方法转换：ACQUITY Arc系统帮助您重现既有方法的新型工具

在本应用纪要中，使用Arc Multi-flow path技术的流路1从其他生产商的HPLC系统向ACQUITY Arc系统进行方法转移。

该流路专为方法转移而设计，使ACQUITY Arc系统能够模拟典型HPLC系统的延迟体积。该方法得到的保留时间与原始方法相差不超过5%。此外，还通过Gradient SmartStart技术进行了保留时间的微调，调整了方法初始条件的持续时间，无需更改梯度表。将上述两种功能联用可简化ACQUITY Arc系统上的方法转移步骤，仅需两次进样，步骤如下：

1. 使用适合的流路（1或2）向ACQUITY Arc系统进行方法转移。
   
2. 比较色谱图并评估保留时间。
3. 如果保留时间不符合方法要求，则使用Gradient SmartStart调整梯度起始点。重新运行方法。

优势

• 能够使用Arc Multi-flow path技术在两种带有不同延迟体积的流路中进行选择

• 能够使用Gradient SmartStart技术通过单次设定调整进样梯度起始点

• 通过时间单位而非体积单位来调整梯度的起始点，从而实现直观的方法转移调节

方法转移过程中通常会出现保留时间漂移。保留时间会受到系统和泵特性差异的影响，诸如延迟体积和混合特性。许多实验室需要在不进行调整的条件下应用某方法，尤其是对于已验证的方法。即使必须进行调整，通常也需要按照法规指南进行。USP指导原则的第<621>章对延迟体积的相关表述为“如果必须进行调整，更改...允许调整初始等度保持时间（如有规定）和/或延迟体积”¹。而针对延迟体积的调整可手动录入梯度表，该方法需要进行计算并手动更改梯度表；上述两项操作均需额外耗费时间和精力。通过软件功能调整梯度起始与进样点之间的时间，可实现对梯度保持时长的调整。完成上述操作时无需更改梯度表，从而使诸如ACQUITY Arc之类的系统能够采用不同的延迟体积来模拟系统。该功能允许实时输入值，因此方法转移得以简化，您可以确定保留时间的差异，然后对初始条件的持续时间进行相应调整。 

在样品瓶中，将20 μL制备型色谱混合标准品（部件号186006703）和100 μL ACQUITY UPLC MS启动溶液2（部件号700002741）与880 μL 30:70 H₂O:乙腈混合。各组分最终浓度如下所列。 

本实验使用安捷伦1260四元液相色谱系统对含有两种主要组分和五种次要组分的样品进行了分析，然后在不更改方法条件或色谱柱的前提下，将该方法从安捷伦1260系统转移至ACQUITY Arc系统。由于梯度分离时保留时间发生漂移的部分原因是仪器延迟体积的差异，因此ACQUITY Arc系统配置为使用Arc Multi-flow path技术的Flow Path 1。此仪器的特点是能够利用六通阀在泵到进样器的两条不同流路（每条流路具有不同的物理体积）之间进行切换（图1）。选择流路1，即意味着ACQUITY Arc系统中延迟体积约为1.1 mL — 该值为许多HPLC系统的常规值。本研究中未选择的流路2所形成的系统延迟体积为0.76 mL。

ACQUITY Arc系统在使用流路1时可得到与安捷伦1260四元系统相似的保留时间分离结果（图2，表1）。所有分析物的保留时间与最初在安捷伦1260 Infinity系统中得到的分离结果相差不超过3%，但色谱峰3存在明显漂移，保留时间相差0.10 min，此漂移程度比所有其他峰的漂移程度大5–10倍。由于该峰的漂移程度大于在其前后洗脱的峰，因此无法将其产生原因完全归结为延迟体积。检查梯度程序后发现该峰在第一梯度步骤的中间部分洗脱出来，但有诸多因素能够影响分离结果，例如梯度延迟、混合以及梯度形状这些泵特性差异都会影响保留时间。其他研究（未在此进行说明）表明峰3的保留时间漂移受梯度形状影响。 

调整保留时间的方法之一是调整分离时初始条件的持续时间。在ACQUITY Arc系统中，可将梯度执行时间调整为“进样时”、“进样后”或“进样前”，使系统能够模拟其他延迟体积较大或较小的色谱系统（图3）。延迟体积的调整(Gradient SmartStart)无需对梯度表做任何更改，调整时可输入时间或体积，因此可灵活模拟不同的HPLC系统。

我们可利用此功能对之前所介绍的示例进行方法转移。尽管方法转移所得到的保留时间结果与原分离结果的差异在5%以内（代表了典型的峰鉴定保留时间窗口值），但系统仍然可通过调整延迟体积来进一步满足更加严苛的保留时间要求。使用安捷伦1260和ACQUITY Arc系统得到的分析结果叠加色谱图表明峰3存在明显的保留时间漂移。研究通过测定各个峰的保留时间确定了峰3的保留时间漂移为0.1 min，而其余峰的漂移要小得多，仅为0.01–0.02 min（图4）。使用上述方法可将ACQUITY Arc系统中的梯度起始点调整为进样0.05 min后开始，以提升峰3的保留时间相关性。选择该值的原因是因为它是保留时间漂移的中间值。

调整方法初始条件的持续时间后，各分析物保留时间的漂移介于0.01 - 0.05 min之间（表2）。最开始的两个峰（对乙酰氨基酚和咖啡因）的保留时间变化最小(< 0.02 min)，之后洗脱峰的保留时间漂移更接近梯度调整值0.05 min。对于目标分析物来说（峰3），保留时间向前漂移0.06 min，因此导致保留时间相对于安捷伦1260 Infinity系统的结果出现了1.5%的偏差（图5）。对保留时间进行调整所得到的效果可能会有所不同，具体取决于洗脱时的流动相组分。当分析物在等度保持阶段或流动相恒定的条件下洗脱时，保留时间的漂移将近似于梯度起始点的变化。如果峰在梯度条件下洗脱出来，则更改溶剂输送的时间对保留时间的影响将更为复杂。

但是，可以通过调整梯度起始点实现对保留时间的微调。与安捷伦1260分离对比，梯度起始点的变化最多能够生成1.4%的保留时间偏差。与ACQUITY Arc系统上的首次分析相比，本研究通过调整梯度起始点得到了相近的平均偏差，及更低最大偏差或差异。 

ACQUITY Arc系统的主要功能之一是能够从其他HPLC系统轻松转移传统/已有的HPLC方法（例如，USP或NF）。本示例中，使用Arc Multi-flow path技术的流路1从其他生产商的HPLC系统向ACQUITY Arc系统进行方法转移。该流路专为方法转移而设计，使ACQUITY Arc系统能够模拟典型HPLC系统的延迟体积。该方法得到的保留时间与原始方法相差不超过5%。此外，还通过Gradient SmartStart技术进行了保留时间的微调，调整了方法初始条件的持续时间，无需更改梯度表。将上述两种功能联用可简化ACQUITY Arc系统上的方法转移步骤，仅需两次进样，步骤如下：

1. 使用适合的流路（1或2）向ACQUITY Arc系统进行方法转移。
2. 比较色谱图并评估保留时间。
3. 如果保留时间不符合方法要求，则使用Gradient SmartStart调整梯度起始点。重新运行方法。

In United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 37-NF 32 S2).; United Book Press, Inc.: Baltimore, MD, 2014; Vol., p 6376.